ELISA屬固相，抗原、抗體的結合只在固相表面上發作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標本，其間的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的時機，只有靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的進程，因而需經分散才干到達反響的終點。在其后參加的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反響總是需求必定時刻的溫育。
ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不可濺起，不可發作氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規則的量參加板孔中。
每次加標本應更換吸嘴，以免發作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標本，然后在微型震動器上震動1分鐘以保證混和。
加酶結合物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器，使加液進程敏捷完成。在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反響的完成需求有必定的溫度和時刻，這一保溫進程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的適宜溫度。在建立ELISA辦法作反響動力學研究時，試驗表明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經1-2小時，ELISA試劑盒產品的生成可達高峰。為加速反響，可進步反響的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為完全，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以形成多的沉積。但因所需時刻太長，在ELISA中一般不予選用。
